Lumineszenzkodierung von Polymermikrokügelchen mit organischen Farbstoffen und Halbleiterquantenpunkten während der Polymerisation

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 12061 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Lumineszenzkodierte Mikrokügelchen sind wichtige Werkzeuge für viele Anwendungen in den Lebens- und Materialwissenschaften, die Lumineszenzdetektion sowie Multiplex- und Barcode-Strategien nutzen. Die Herstellung solcher Perlen umfasst häufig das Anfärben vorgefertigter Perlen mit molekularen Luminophoren mithilfe einfacher Quellverfahren oder die Oberflächenfunktionalisierung mit Schicht-für-Schicht-Techniken (LbL). Alternativ werden diese Luminophore während der Polymerisationsreaktion sterisch eingebaut, wodurch die Polymerkügelchen entstehen. Die günstigen optischen Eigenschaften von Halbleiterquantenpunkten (QDs), die breit anregbare, größenabstimmbare, schmale Emissionsbanden und eine geringe Photobleichempfindlichkeit aufweisen, lösten die Herstellung von mit QDs gefärbten Perlen aus. Die kolloidale Natur und die Oberflächenchemie dieser QDs, die ihre Lumineszenzeigenschaften weitgehend steuert, stellen jedoch neue Herausforderungen für die Perlenkodierung dar, die bisher kaum systematisch untersucht wurden. Um einen unkomplizierten Ansatz für die Perlenkodierung mit QDs mit minimiertem Lumineszenzverlust zu etablieren, haben wir systematisch den Einbau von Ölsäure/Oleylamin-stabilisierten CdSe/CdS-Kern/Schale-QDs in 0,5–2,5 µm große Polystyrol (PS)-Mikrokügelchen untersucht durch eine einfache Dispersionspolymerisationssynthese, die zunächst mit dem organischen Farbstoff Nilrot optimiert wurde. Zu den Parametern, die für die Herstellung von Luminophor-kodierten Perlen berücksichtigt werden, gehören die Verwendung eines polymerkompatiblen Liganden wie Benzyldimethyloctadecylammoniumchlorid (OBDAC) für die QDs und die Vernetzung, um ein Austreten von Luminophor zu verhindern. Die physikalisch-chemischen und optischen Eigenschaften der resultierenden Perlen wurden mit Elektronenmikroskopie, dynamischer Lichtstreuung, optischer Spektroskopie und Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Als Maß für die Perlenqualität wurden die Partikelgrößenverteilung, die Fluoreszenzquantenausbeute der eingekapselten QDs und die QD-Leckstabilität verwendet. Das abgeleitete optimierte Bead-Kodierungsverfahren ermöglicht die reproduzierbare Herstellung heller PS-Mikrokügelchen, die sowohl mit organischen Farbstoffen als auch mit CdSe/CdS-QDs codiert sind. Obwohl diese Perlen im Vergleich zu den anfänglich sehr stark lumineszierenden QDs eine verringerte Photolumineszenz-Quantenausbeute mit Werten von etwa 35 % aufweisen, ist ihre Photolumineszenz-Quantenausbeute dennoch immer noch moderat.

Lumineszierende Polymerkügelchen, die entweder mit molekularen oder nanoskaligen Luminophoren kodiert sind, werden in den letzten Jahrzehnten zunehmend in den Lebens- und Materialwissenschaften in Verbindung mit Fluoreszenzspektroskopie, Mikrofluormetrie, Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie eingesetzt. Solche Partikel sind häufig mit funktionellen Oberflächengruppen ausgestattet, an die Erkennungseinheiten wie Proteine und Antikörper oder auf Analyten reagierende Farbstoffe gebunden werden können1,2. Dies eröffnet viele verschiedene Anwendungen, darunter (Bio-)Bildgebung, biomedizinische Tests und chemische Sensorik3,4,5,6,7,8. Während lumineszierende Polymer-Nanokügelchen häufig für Zellmarkierungs- und Assay-Plattformen verwendet werden, werden üblicherweise größere Mikrokügelchen für perlenbasierte Bioassays und Spektralmultiplexverfahren verwendet8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21, wobei entweder Farbkodierung oder neuerdings auch Lebenszeitkodierung22 in Verbindung mit Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird. Hierbei wird die Lumineszenzfarbe oder Lebensdauer der codierten Trägerkügelchen als Identifikationscode für die Oberflächenchemie der Kügelchen verwendet und das anschließend an Kügelchen gebundene eingefangene Ziel wird dann mithilfe einer zusätzlichen spektral unterscheidbaren Fluoreszenzmarkierung quantifiziert. Kodierte Perlen in Nano- und Mikrometergröße können auch für Sicherheits-, Fälschungsschutz- und Authentifizierungsanwendungen sowie für gedruckte Codes verwendet werden23,24,25.

Ein üblicher Ansatz zur Lumineszenzkodierung von Polymerkügelchen besteht darin, vorgefertigte Polystyrol- (PS) oder Polymethylmethacrylat-Kügelchen (PMMA) durch Zugabe eines apolaren organischen Lösungsmittels, das Luminophore enthält, aufzuquellen, wodurch die Luminophore die Kügelchenmatrix durchdringen können26,27,28. Solche Verfahren wurden beispielsweise zur Herstellung von Perlen mit unterschiedlichen Oberflächenfunktionalitäten verwendet, die als Träger für Plattformen auf Perlenbasis verwendet werden5. Alternativ kann eine schichtweise Beschichtung vorgefertigter Perlen durchgeführt werden. Dieser vielseitige Ansatz beinhaltet die schrittweise Abscheidung von Schichten entgegengesetzt geladener Polyelektrolyte, die Nanokristalle wie kolloidale Halbleiterquantenpunkte (QDs) oder organische Farbstoffe29,30,31,32 enthalten. Dadurch wird nur eine Oberflächenfärbung erreicht und die entsprechend veränderte Oberflächenchemie der Kügelchen kann die nachfolgenden Biokonjugationsschritte vor Herausforderungen stellen. Eine weitere Methode ist der Einbau des Luminophors während der Polymerisationsreaktion, sowohl für organische Farbstoffe33,34,35,36 als auch für verschiedene Nanokristalle13,37,38,39,40,41,42,43. Dabei wird die lumineszierende Verbindung in der Monomerlösung gelöst oder dispergiert oder dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Dieses Verfahren kann eine homogene Luminophorverteilung innerhalb der Perlen liefern, erfordert jedoch ausreichend stabile Emitter mit einer geeigneten Löslichkeit oder Dispergierbarkeit, die den gelegentlich rauen Polymerisationsbedingungen standhalten können44.

Während Verfahren zum Einbau organischer Farbstoffmoleküle in Polymerkügelchen unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung, Größe und Oberflächenchemie relativ gut etabliert sind, ist die Kodierung von Kügelchen mit nanoskaligen Luminophoren wie QDs mit ihren sehr breiten Absorptionsspektren, schmalen Emissionsbanden und hoher Photostabilität weit entfernt komplexer3,17,45. Diese lumineszierenden Nanokristalle mit Größen < 10 nm haben üblicherweise eine Kern/Schale-Partikelarchitektur, die aus einem anorganischen Kern, einer anorganischen Oberflächenpassivierungsschale und einer stabilisierenden organischen Ligandenschale besteht, die Dispergierbarkeit und kolloidale Stabilität gewährleistet46. Da die Oberflächenchemie der QDs nicht nur für ihre kolloidale Stabilität sehr wichtig ist, sondern auch weitgehend ihre Photolumineszenz (PL)-Eigenschaften, insbesondere ihre Photolumineszenz-Quantenausbeute, steuert, stellt dies erhebliche Herausforderungen für die Kodierung von Polymerkügelchen dar, ohne dass die QD-Aggregation und ein erhebliches Risiko einhergehen Verlust der QD-Lumineszenz4,38,41,47,48,49. Dies hängt mit der Tatsache zusammen, dass der Bead-Inkorporationsprozess die Anzahl der Liganden auf der QD-Oberfläche verändern kann, wodurch zusätzliche Fallenzustände durch Ligandenentfernung eingeführt werden, oder dass zunächst ein Ligandenaustausch erforderlich ist, um die Kompatibilität der QD-Oberflächenchemie mit dem Monomer/der Monomere sicherzustellen. Polymerphase, die ebenfalls zu einer Lumineszenzlöschung führen kann47.

Die reproduzierbare Kodierung mit Nanokristallen wie QDs erfordert die sorgfältige Berücksichtigung aller Parameter, die ihre kolloidale Stabilität und Funktionalität steuern, und daher häufig eine Anpassung der für molekulare Luminophore etablierten Kodierungsverfahren. Die Verwendung eines Quellverfahrens, über das für verschiedene Arten von Polymerkügelchen berichtet wurde17, 20, 47, 50, erfordert eine sorgfältige Kontrolle der Porengrößenverteilung innerhalb der Kügelchen und kann zu inhomogener Kügelchenfärbung, einer niedrigen QD-Beladungsdichte und einem Mangel an … führen Reproduzierbarkeit und daraus resultierende QD-Leckage47. Darüber hinaus können der Quellvorgang und die Lösungsmittel die Lumineszenzeigenschaften der QDs erheblich beeinflussen und zu einer Lumineszenzlöschung führen. Die schichtweise Beschichtung vorgefertigter Partikel unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung für QDs ist zeitaufwändig, kann zu einer Verbreiterung der anfänglichen Perlengrößenverteilung führen und erfordert unterschiedliche Reinigungsschritte, was zu Materialverlusten führt51,52,53,54,55. Auch der Einfluss dieses Kodierungsverfahrens auf die PL-Eigenschaften der eingebauten QDs wurde noch nicht systematisch bewertet. Das am häufigsten verwendete Verfahren zur Herstellung von QD-kodierten Perlen besteht in der Einbindung der QDs während der Polymerisationsreaktion, z. B. zur Herstellung von PS-Mikropartikeln oder PS-Perlen, die Divinylbenzol (DVB) oder PMMA enthalten4,13,37,38, 39,40,41,42,43,48,56,57,58,59,60 und Polyisopren sowie Poly(milch-co-glycolsäure)-Perlen2,3,45,61. Zu den verwendeten Polymerisationstechniken gehören (Mini-)Emulsions- und Suspensionspolymerisation4,13,37,38,39,40,41,42,43,47,56,58,59 sowie kompliziertere mikrofluidische Ansätze9,10,14,16,62 . Fast alle dieser Verfahren nutzen Cd-basierte QDs wie CdSe, CdSe/ZnS oder CdTe, die üblicherweise mit einer Kombination aus Trioctylphosphin (TOP)/Trioctylphosphinoxid (TOPO)-Liganden stabilisiert werden. Gelegentlich wurde ein polymerisierbarer Ligand in die QD-Oberfläche eingeführt, um die Kompatibilität der QDs mit der Reaktionsmischung zu verbessern und den Perleneinbau zu verbessern48,57.

Trotz zahlreicher Berichte über QD-kodierte Polymerkügelchen wurde der Einfluss des Kügelcheneinbaus auf die PL-Eigenschaften von QDs bisher nicht systematisch untersucht und häufig werden die PL-Merkmale der anfänglichen QDs nicht oder nur sehr grob mit denen der QDs verglichen resultierende QD-gefärbte Perlen. Insbesondere Änderungen in der Quantenausbeute (PLQY) der Photolumineszenz (PL) wurden nicht gründlich untersucht, obwohl diese Eigenschaft, die der Anzahl der emittierten pro Anzahl der absorbierten Photonen entspricht, weitgehend die Intensität des PL-Signals und die Perlenhelligkeit bestimmt. Darüber hinaus bietet PLQY ein direktes Maß für die Qualität und Dichtheit von QD-Oberflächenpassivierungshüllen und ermöglicht Einblicke in Veränderungen in der Ligandenhülle49,63,64. Dies ermutigte uns, ein einfaches Verfahren zur Synthese lumineszierender PS-Mikrokügelchen mit einer Größe von etwa 1 μm zu entwickeln, die mit hydrophoben organischen Farbstoffen und ligandenstabilisierten Kern/Schale-QDs über eine Dispersionspolymerisation von Styrol mit minimiertem Verlust an anfänglicher Lumineszenz kodiert sind. Daher wurden stellvertretend für Nilrot (NR) und Ölsäure (OA)/Oleylamin (OLA) stabilisierte CdSe/CdS-Kern/Schale-QDs verschiedene Polymerisationsbedingungen wie Temperatur, Rührgeschwindigkeit, Initiatormenge, Reaktion systematisch untersucht Zeit und die Zugabe des Vernetzers Divinylbenzol (DVB) sowie QD-Oberflächenchemie und die Verwendung eines polymerkompatiblen QD-Oberflächenliganden. Die Charakterisierung der kodierten Mikrokügelchen umfasste die Bestimmung der Partikelgröße und Größenverteilung mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) und Elektronenmikroskopie sowie die Elementkartierung der QD-kodierten Kügelchen mittels energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDXS) für QD Lokalisierung innerhalb der Perlen. Darüber hinaus wurden die Fluoreszenzeigenschaften der Luminophore vor der Polymerisationsreaktion und in den Perlen durch PL- und Ulbrichtkugel-Spektroskopie sowie im Fall der mit Luminophor gefärbten Perlen durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) bestimmt. Dadurch konnten wir Parameter identifizieren, die stark lumineszierende PS-Mikrokügelchen mit einer engen Größenverteilung und einem minimierten, wenn auch immer noch spürbaren PLQY-Verlust der in die Kügelchen integrierten QDs liefern.

Styrol (≥ 99,0 %), Divinylbenzol (DVB, 80 %), Azobisisobutyronitril (AIBN, 98 %), Zinn(II)-2-ethylhexanoat (92,5–100 %), ε-Caprolacton (97 %), Polyethylenglykol (PEG, MW 2.500), Trioctylphosphinoxid (TOPO, 99 %), 1-Octadecen (ODE, 90 %), Toluol (≥ 99,7 %), Methanol (≥ 99,8 %), Isopropanol (≥ 99,8 %), Oleylamin (OLA , 70–80 %), 1-Octanthiol (98,5 %) und Aceton (≥ 99,5 %) wurden von Sigma Aldrich Co. erhalten. Polyvinylpyrrolidon (PVP, MW 40.000), Cadmiumoxid (CdO, 99,998 %), Selenpulver (200 Mesh). , 99,999 %) und Ölsäure (OA, 90 %) wurden von Alfa Aesar bezogen. Toluol, Ethanol und n-Heptan (alle Spektralqualität) sowie n-Hexan (≥ 99 %) wurden von Merck KGaA bezogen. Ethanol (abs., 99,9 %) und Dichlormethan (HPLC-Qualität) wurden von Chemsolute bezogen. Benzyldimethyloctadecylammoniumchlorid (OBDAC, 98,9 %) wurde von HPC Standards GmbH, Nilrot (NR) von Fluka Analytical, n-Octadecylphosphonsäure (ODPA, > 99 %) von PCI Synthesis und Tri-n-octylphosphin (TOP, 99,7 %) bezogen. sowie deuteriertes Chloroform (99,8 Atom-%) von ABCR. Alle für die optischen Messungen verwendeten Lösungsmittel waren von spektroskopischer Qualität und alle Chemikalien wurden im Originalzustand ohne weitere Reinigung eingesetzt.

Die Ölsäure (OA)/Oleylamin (OLA)-stabilisierten CdSe/CdS-Kern/Schale-QDs wurden gemäß einer modifizierten Synthese synthetisiert, die von Carbone et al., Nightingale et al. beschrieben wurde. und Chen et al.65,66,67, was ausführlich in den Zusatzinformationen (SI) beschrieben wird.

Das Blockcopolymer Polyethylenglycol-Block-Poly(ε-caprolacton) (PEG-b-PCL) wurde nach einem angepassten Verfahren von Meier et al.68 synthetisiert und ist im SI ausführlich beschrieben.

Für die Beschichtung der OA/OLA-stabilisierten QDs wurde eine Spatelspitze OBDAC zu 100 µL der QD-Lösung in Toluol in einem Fläschchen gegeben. Dann wurde Ethanol zugegeben, um ein Volumen von 1 ml zu erreichen, und die Mischung wurde 5 Minuten lang bei 200 U/min auf einen Schüttler gestellt. Die ausgefällten QDs wurden dann mit einer Eppendorf Microcentrifuge 5415 D 5 Minuten lang bei 8000 U/min zentrifugiert und einmal mit Ethanol gewaschen. Die mit OBDAC beschichteten QDs wurden in 1 ml Styrol redispergiert, versiegelt und bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank aufbewahrt.

Die Synthese der kodierten PS-Mikrokügelchen wurde nach einem modifizierten Verfahren durchgeführt, das von Acter et al.69 beschrieben wurde, und die Vernetzung der Kügelchen wurde nach einem Verfahren von Li et al.70 durchgeführt. Zunächst wurden 36,6 mg PEG-b-PCL in 403 µL Toluol gelöst. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 200 U/min auf einen Schüttler gestellt, um das Copolymer aufzulösen. In der Zwischenzeit wurden 1,465 g PVP und 36,6 mg AIBN nacheinander in 40 ml Ethanol gelöst.

Zur Farbstoffkodierung der Polymerkügelchen wurden 4 mg Nilrot in 4 ml Styrol und 200 µL DVB gelöst und die Mischung anschließend kurz beschallt. Die ethanolische Mischung, die Farbstoff-Monomer-Mischung und in Toluol gelöstes PEG-b-PCL wurden in dieser Reihenfolge in einen 100-ml-Zweihalsrundkolben gegeben. Typischerweise wurde der Kolben unter Argon verschlossen und in einem Ölbad auf 70 °C erhitzt. Die Reaktion wurde 24 Stunden lang bei 70 U/min gerührt, bevor sie auf RT abgekühlt wurde. Falls Parameter für die Bead-Synthese variiert wurden, wird dies im folgenden Abschnitt explizit angegeben. Die resultierende Partikeldispersion wurde 10 Minuten lang mit 2000 rcf zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und die verbleibenden Partikel wurden einmal 10 Minuten lang mit Ethanol bei 1600 rcf gewaschen. Für diese Waschschritte wurde eine Multifuge X1R von Thermo Fisher Scientific Inc. verwendet. Die Polymermikrokügelchen wurden dann in Ethanol redispergiert und bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert. Zur analytischen Charakterisierung wurde die Partikelstammlösung zusätzlich dreimal mit Ethanol gewaschen und jedes Mal für 10 Minuten bei 700 rcf zentrifugiert, um kleinere Perlen abzutrennen und eventuell verbleibende Syntheserückstände wie Styrol oder AIBN zu entfernen. Diese Waschschritte wurden mit einer Eppendorf Microcentrifuge 5415 D durchgeführt.

Für die QD-Kodierung der Polymerkügelchen wurde 1 ml einer Dispersion von OBDAC-beschichteten, Ölsäure/Oleylamin-stabilisierten CdSe/CdS-QDs in Styrol, hergestellt wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, zu 3 ml Styrol gegeben. Zur Vernetzung der Perlen wurden 50–200 µL DVB zugegeben und die Mischung kurz beschallt. Die ethanolische Mischung sowie die PEG-b-PCL-Lösung in Toluol wurden wie oben beschrieben hergestellt und zusammen mit der QD-Monomermischung in den Kolben gegeben. Das Reaktionsverfahren wurde ansonsten unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, die für die Herstellung der farbstoffkodierten Mikropartikel verwendet wurden.

Ein Lösungs-1H-NMR-Spektrum des synthetisierten PEG-b-PCL wurde bei RT mit einem 400 MHz JEOL JNM-ECX400-Spektrometer an der Freien Universität Berlin aufgenommen. Die PEG-b-PCL-Probe wurde durch Auflösen von 6 mg PEG-b-PCL in 700 µL CDCl3 hergestellt. Das entsprechende Spektrum, das die chemische Identität des Copolymers bestätigt, wird im SI angezeigt (Abb. S1).

1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ = 1,38 (m, 2H, γ), 1,63 (m, 4H, β und δ), 2,30 (m, 2H, α), 3,64 (s, 4H, a und b ), 4,05 (t, 2H, ε), 4,21 (t, 2H, b).

Das zahlenmittlere Molekulargewicht Mn des synthetisierten PEG-b-PCL wurde aus dem Verhältnis der Protonen der PEG- und PCL-Signale nach Meier et al.68 zu etwa 4840 g/mol berechnet.

DLS- und Zetapotentialmessungen der verschiedenen Mikropartikel wurden mit einem Zetasizer Nano ZS von Malvern Panalytical Ltd. bei T = 25 °C in gefalteten Einwegkapillarzellen (DTS1070), ebenfalls von Malvern Panalytical Ltd., durchgeführt. Alle Partikel wurden in Milli- Q-Wasser (Millipore) für diese Messungen.

HAADF-STEM-Messungen wurden mit einem 200 kV JEOL JEM-2100F-UHR durchgeführt, der bei 200 kV betrieben und mit einer Feldemissionskanone ausgestattet war, sowie einem Oxford Instruments INCA 200 für energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDXS), was eine Elementkartierung ermöglichte. Die Proben wurden auf kohlenstoffbeschichteten Kupfergittern (Quantifoil) durch Tropfengießen der ethanolischen Mikrokügelchendispersion hergestellt.

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen wurden mit einem JEOL JSM-6700F aufgenommen. Die aus den ethanolischen Mikrokügelchendispersionen entnommenen Proben wurden auf Messinghalter tropfengegossen. Die Messungen wurden mit niedriger Beschleunigungsspannung und niedrigem Beschleunigungsstrom (1 kV und 2 µA) durchgeführt.

AAS-Messungen wurden mit einem AA140-Gerät von Varian Inc. mit einem Sauerstoff/Acetylen-Flammenzerstäuber durchgeführt, um die Cd(II)-Konzentration in der QD-Dispersion zu bestimmen. Proben der QD-Dispersionen wurden durch Auflösen der Partikel mit Königswasser hergestellt. Zur Erstellung einer Kalibrierkurve zur Quantifizierung der Cd(II)-Konzentration wurden sechs Standardlösungen mit unterschiedlichen Cd(II)-Konzentrationen verwendet.

Absorptionsspektren der CdSe/CdS-QDs und Nilrot in Toluol/Styrol und der jeweils kodierten Mikrokügelchen in Ethanol wurden mit einem Specord 210plus Spektrophotometer von Analytik Jena bei RT in (10 × 10) mm Quarzglasküvetten der Hellma GmbH aufgenommen. Die verschiedenen QD- und farbstoffkodierten Perlen für die Leckexperimente wurden in MilliQ-Wasser dispergiert und unter den gleichen Bedingungen und Geräteeinstellungen gemessen.

Emissionsspektren der CdSe/CdS-QDs und Nilrot in Toluol/Styrol und der jeweils kodierten Mikrokügelchen in Ethanol wurden mit einem FSP920-Fluoreszenzspektrometer von Edinburgh Instruments Ltd. bei RT in (10 × 10) mm Quarzglasküvetten der Hellma GmbH aufgenommen . Die Anregungswellenlänge wurde auf 350 nm eingestellt.

Die Photolumineszenz-Quantenausbeuten (PLQY) von Lösungen der Luminophore in Styrol/Toluol und der Luminophor-kodierten Mikropartikel in Ethanol wurden absolut mit einem eigenständigen Quantaurus Ulbrichtkugel-Aufbau von Hamamatsu Photonics KK bestimmt. Die Messungen wurden bei 25 °C in ( 10 × 10) mm, Langhals-Quarzglasküvetten von Hamamatsu Photonics K. K mit einer Anregungswellenlänge von 350 nm. Für PLQY-Messungen transparenter Luminophorlösungen wurde das jeweilige Lösungsmittel als Blindwert verwendet. Für alle kodierten Mikrokügelchendispersionen wurden Dispersionen ungefärbter einfacher Mikropartikel ähnlicher Größe und Perlenkonzentration als Blindwert verwendet.

CLSM-Messungen wurden mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Olympus FV1000 (Olympus, Deutschland) auf Basis des motorisierten Umkehrmikroskops Olympus IX81 (Olympus, Deutschland) und einem 60-fachen Wasserimmersionsobjektiv (AN = 1,2) durchgeführt. Transmissionsbilder wurden bei 488 nm gemessen. Für die Aufnahme der Fluoreszenzbilder wurde für eine optimale Signalintensität eine Anregung mit einem 458-nm-Laser (87 % Laserleistung) und einem 355-nm-Laser (99 % Laserleistung) eingesetzt und die Fluoreszenzemission im Bereich von 560–660 aufgezeichnet nm. Für diese Experimente wurden die Mikrokügelchen-Stammlösungen dreimal mit MilliQ-Wasser gewaschen, in MilliQ-Wasser redispergiert und auf eine Konzentration von 0,2 mg/ml verdünnt. 1 µL der Probe wurde auf einen 0,17-mm-Glasobjektträger aufgetragen.

Die kurzfristige Photostabilität der NR- und QD-kodierten Kügelchen wurde mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Olympus FV1000 von Olympus, Deutschland, basierend auf dem motorisierten Inversmikroskop Olympus IX81 von Olympus, Deutschland, und einem 60-fachen Wasserimmersionsobjektiv (AN) untersucht = 1,2). Fluoreszenzbilder mit einer speziellen Region of Interest (ROI) wurden mit einem 458-nm-Laser für die QD-kodierten Kügelchen (Emissionsbereich 580–680 nm) und einem 514-nm-Laser für die NR-kodierten Kügelchen (Emissionsbereich 560–660 nm) aufgenommen ). Die Bildgröße wurde auf 512*512 px eingestellt und eine Scangeschwindigkeit von 8 µs/px verwendet, was zu einer Bildaufnahmezeit von 2,1 s führte. Für die beiden Anregungslichtquellen wurde eine Anregungsleistung von 1 mW im Strahlengang ermittelt. Zur Probenvorbereitung wurden die Mikrokügelchen-Stammlösungen dreimal mit MilliQ-Wasser gewaschen, in MilliQ-Wasser redispergiert und auf eine Konzentration von 0,2 mg/ml verdünnt. 1 µL der Probe wurde auf einen 0,17 mm Glasobjektträger aufgetragen und vor den Messungen trocknen gelassen.

Die Langzeitstabilität des Farbstoffs NR, der QDs sowie NR- und QD-kodierter Perlen gegenüber Sonnenlicht wurde mit einem SUNTEST CPS+-Setup der Atlas Material Testing Technology GmbH getestet. Die getrockneten Proben wurden sieben Tage lang mit einer Leistungsdichte von 650 W/m2 und einer maximalen Kammertemperatur von 60 °C beleuchtet. Die PL-Intensität der getrockneten Feststoffproben von NR, QDs und der NR- und QD-kodierten Polymerkügelchen wurde in Intervallen von 24 Stunden mit einem Spektrofluorometer Dual-FL gemessen, das mit einer Quanta-Phi-Ulbrichtkugel ausgestattet war, beide von Horiba Scientific.

Die Vielseitigkeit von Dispersionspolymerisationen, die in Lösungsmitteln wie Wasser oder Ethanol durchgeführt werden können, in Kombination mit ihrer guten Reproduzierbarkeit und hohen Ausbeuten machen diesen Ansatz für die Synthese von Luminophor-kodierten Polymernanopartikeln und Mikropartikeln sehr attraktiv. Polymernanopartikel mit Größen von etwa 50–200 nm und einer engen Größenverteilung können mit diesem klassischen Ansatz unter Verwendung eines Monomers, eines Tensids und eines Radikalstarters synthetisiert werden3,4,35,39,40,43,45,48,56, 57,58,59,61. Für die Perlenkodierung mit hydrophoben organischen Farbstoffen, die ausreichend stabil sind, um die Polymerisationsbedingungen zu überstehen, wird der Luminophor üblicherweise direkt im flüssigen Monomer gelöst. Die Synthese von Mikropartikeln mit Größen von etwa 500 nm bis zu mehreren hundert µm erfordert einige Modifikationen dieses Verfahrens, insbesondere für den Einbau kleiner Nanokristalle wie QDs2,8,10,11,12,13,14,37,38,40 ,41,42,43,47,48,62. In der folgenden Arbeit wird die Optimierung dieses Verfahrens exemplarisch für den solvatochromen, hydrophoben und ausreichend stabilen Farbstoff Nile Red (NR) durchgeführt, der von uns zuvor zur Beurteilung und Optimierung der Beladung vorgefertigter PS-Nanopartikel und Mikropartikel mit a eingesetzt wurde Schwellungsverfahren26,27. Dies wurde durchgeführt, um die Perlensynthese für den einfachsten Fall, einen kleinen molekularen Fluorophor, zu etablieren und seine allgemeine Eignung für die Herstellung homogen gefärbter Perlen zu zeigen. Anschließend ermittelten wir die optimalen Bedingungen für die Herstellung heller und stabiler QD-kodierter PS-Mikropartikel. Dabei wird jeweils nur ein Parameter variiert. Dadurch kann der Einfluss des Copolymers PEG-b-PCL, der QD-Beschichtung mit OBDAC und der Vernetzung mit DVB nacheinander beurteilt werden. Das optimierte Reaktionsverfahren, das für die Farbstoff- und QD-Kodierung von PS-Mikrokügelchen mit Größen von 0,5–2,5 μm abgeleitet wurde, ist schematisch in Abb. 1 dargestellt.

Schematische Darstellung der Synthesewege zur Herstellung der lumineszierenden Polystyrol (PS)-Mikrokügelchen, kodiert mit (a) Nilrot, (b) OA/OLA-stabilisierten CdSe/CdS-QDs ohne Vorbehandlung und (c) OA/OLA -stabilisierte CdSe/CdS-QDs, synthetisiert mit dem entwickelten und optimierten Verfahren, einschließlich der Vorbehandlung der QDs mit dem polymerkompatiblen Liganden OBDAC. Die Fotografien der jeweiligen ethanolischen Perlendispersionen wurden unter Tages- und UV-Licht aufgenommen.

Durch Dispersionspolymerisation hergestellte PS-Mikrokügelchen weisen tendenziell eine breite Größenverteilung auf. Dies wird hauptsächlich durch die während der langen Wachstumszeiten auftretende Sekundärkeimbildung verursacht, die zu unterschiedlich großen Polymerpartikeln führt. Um dieser Herausforderung zu begegnen, fügten wir dem Reaktionsgemisch das Blockcopolymer PEG-b-PCL zu, wie von Acter et al.69 beschrieben. Die Zugabe dieses amphiphilen Copolymers verhindert sekundäre Keimbildung und Aggregation während der Perlensynthese, indem es die wachsenden Partikel sterisch stabilisiert. Die Wirkung von PEG-b-PCL auf die Größenverteilung der resultierenden PS-Mikrokügelchen ist in Abb. 2 dargestellt. Die REM-Bilder und die abgeleiteten Histogramme der Größenverteilung zeigen eine deutlich engere und regelmäßigere Größenverteilung mit einer kleineren Standardabweichung das Vorhandensein von PEG-b-PCL. Während die Partikel ohne PEG-b-PCL aufgrund des höheren AIBN-Anteils im Allgemeinen größer sind, ist dieser Einfluss immer noch deutlich sichtbar. Dies bestätigt den positiven Einfluss von PEG-b-PCL auf die Partikeleigenschaften. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde PEG-b-PCL in allen folgenden Synthesen für Farbstoff- und QD-kodierte Perlen eingesetzt, um eine enge Größenverteilung der gebildeten Perlen sicherzustellen.

SEM-Bilder und Partikelgrößenverteilungen der verschiedenen PS-Mikrokügelchen, hergestellt: (a) ohne Zusatz von PEG-b-PCL (Toluolzusatz ohne PEG-b-PCL; Synthese mit 500 mg AIBN, kein Vernetzer) und (b) mit Zusatz von 36,6 mg PEG-b-PCL in Toluol (Synthese mit 100 mg AIBN, vernetzt mit 200 µL DVB). Für die Herstellung beider Perlentypen verwendete Bedingungen: 75 °C, 70 U/min Rührgeschwindigkeit, 24 h Reaktionszeit.

Die optischen Eigenschaften von NR wurden vor der Partikelsynthese in Styrol bestimmt. Die entsprechenden Absorptions- und Emissionsspektren sind in Abb. 3 dargestellt. Der PLQY von NR in Styrol wurde mit 86 % bestimmt.

Lumineszenzeigenschaften von NR und NR-kodierten PS-Mikrokügelchen. (a) Normalisierte Absorptions- und Emissionsspektren (λexc = 350 nm) von NR in Styrol; (b) PLQY von NR in Styrol und in den resultierenden Mikrokügelchen in Ethanol in verschiedenen Stadien; Emissionsspektren (λexc = 350 nm) von NR-kodierten PS-Mikrokügelchen in Ethanol, hergestellt (c) ohne und (d) mit Zusatz von 200 µL des Vernetzers DVB. Die Emissionsspektren wurden auf die schwarzen Emissionsspektren des Farbstoffs NR normalisiert, die in der anfänglichen Reaktionsmischung vor der Polymerisation aufgezeichnet wurden, um durch die Polymerisation verursachte Änderungen der Fluoreszenz sichtbar zu machen. Für die Herstellung der farbstoffkodierten Mikrokügelchen wurden die folgenden Bedingungen verwendet: 65 °C, 100 mg AIBN, 36,6 mg PEG-b-PCL, 100 U/min Rührgeschwindigkeit und 24 Stunden Reaktionszeit.

Um den Einfluss der Vernetzung auf die PL-Eigenschaften der Perlen zu bewerten, wurden NR-kodierte Mikrokügelchen ohne und mit dem Vernetzer DVB unter Verwendung der gleichen Farbstoffmenge (1 mg/ml Monomer) synthetisiert. Wie aus REM-Bildern hervorgeht, sind die vernetzten Perlen mit einer Größe von 1262 ± 120 nm größer als die nicht vernetzten und weisen eine Größe von 945 ± 166 nm auf. Die Standardabweichung der Partikelgröße beider Perlen ist ähnlich, jedoch etwas höher als bei den zuvor vorgestellten und diskutierten einfachen Partikeln ohne Luminophor-Kodierung.

Die Emissionsspektren der Polaritätssonde NR in der anfänglichen Reaktionsmischung vor der Polymerisation, nach 24 Stunden und nach fünf Waschschritten sind in Abb. 3 dargestellt. Die bathochrome Verschiebung der Emissionsbande von NR in den Polymerisationscocktails wird auf eine Erhöhung zurückgeführt Polarität der Farbstoffumgebung. Bei der Polymerisation verschiebt sich das NR-Emissionsmaximum für beide Arten von Mikropartikeln von 637 auf 610 nm. Der PLQY der Reaktionsmischungen vor der Synthese betrug in beiden Fällen 47 %. Nach einer Reaktionszeit von 24 h wurden jedoch PLQY-Werte von 23 % und 55 % für die unvernetzten und vernetzten Mikropartikel erhalten. Nach fünf Waschschritten betrug der PLQY beider Perlentypen 74 %. Die Abnahme des PLQY im Vergleich zu NR in Styrol (86 %) wird auf eine leicht erhöhte Polarität der Farbstoffumgebung in den PS-Perlen zurückgeführt, die bekanntermaßen den PLQY von NR26,71 verringert. Dies wird durch die leichten bathochromen Verschiebungen der Emissionsspektren gestützt, die in den Feldern c und d von Abb. 3 dargestellt sind.

Obwohl es, wie bereits erwähnt, mehrere Berichte über die Herstellung von QD-kodierten Perlen gibt, wurde der Einfluss der Polymerisationsreaktion und der Perlenmatrix auf die optischen Eigenschaften von QDs bisher nur selten systematisch bewertet, meist nur durch Vergleich der Emissionsmaxima und nach der Reaktion3,4,11,12,13,35,38,39,40,41,42,43,48,56,57,60,61,62. Bisher gibt es nur zwei Beispiele für PLQY-Studien von QDs vor und nach dem Einbau von Kügelchen, eines von Yang et al.41 zu 3-Mercaptopropionsäure-stabilisiertem CdTe in Polystyrol und eines von Sheng et al.48 zu TOP/TOPO -stabilisiertes, zusätzlich oligomer phosphinbeschichtetes CdSe/ZnCdS/ZnS in Polystyrol. In beiden Fällen wurde über einen erheblichen Verlust an PLQY beim Einbau von QD in die Mikrokügelchen berichtet41,48.

Mit dem Ziel, helle QD-kodierte Perlen mit minimalem Verlust an QD-Fluoreszenz und keinem QD-Auslaufen zu erhalten, haben wir die Bedingungen der Polymerisationsreaktion bewertet und optimiert, indem wir DLS-, SEM- und PL-Messungen zur Qualitätskontrolle der Perlen verwendet haben. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen zusammengefasst. 4 und 5. Vor der Synthese wurden die strukturanalytischen und optischen Eigenschaften der mit Ölsäure (OA)/Oleylamin (OLA) stabilisierten CdSe/CdS-QDs mittels TEM sowie Absorptions- und PL-Spektroskopie und der QD-Konzentration untersucht Die verwendete Dispersion wurde durch AAS bestimmt (für beide siehe SI, Abb. S2). Als Werkzeug für die Perlenqualität haben wir uns hier zunächst auf die PL-Eigenschaften der QD-kodierten Perlen konzentriert, mit besonderem Schwerpunkt auf der spektralen Position und spektralen Breite (FWHM: Halbwertsbreite) des QD-Emissionsbandes, die mit der QD korrelieren Größe und Größenverteilung sowie PLQY, das unabhängig von der Perlengröße und der Anzahl der eingebauten QDs ist. Die strukturanalytische Charakterisierung der verschiedenen Arten von QD-kodierten Perlen, die aus QDs mit unterschiedlicher Oberflächenchemie und ohne und in Gegenwart eines Vernetzers erhalten wurden, wird im folgenden Abschnitt detailliert beschrieben, wobei Merkmale wie Perlengröße, Größenverteilung und Oberfläche bewertet werden Morphologie sowie QD-Verteilung innerhalb der Perlen.

Emissionsspektren (λexc = 350 nm) von CdSe/CdS-QDs in der Reaktionsmischung vor der Polymerisationsreaktion und den resultierenden QD-kodierten PS-Mikrokügelchen in Ethanol, erhalten für (a) OA/OLA-stabilisierte QDs, vernetzt mit DVB, ( b) OBDAC-beschichtete, OA/OLA-stabilisierte QDs ohne Vernetzung, mit PEG-b-PCL, (c) für optimierte Bedingungen, d. h. OBDAC-beschichtete, OA/OLA-stabilisierte QDs, Zusatz von PEG-b-PCL, und Vernetzung mit DVB und (d) die entsprechenden PLQY-Werte, die in verschiedenen Reaktionsstadien und für die anfänglichen QDs erhalten wurden. Für die Herstellung der QD-kodierten PS-Perlen verwendete Bedingungen: 75 °C, 36,6 mg AIBN, 36,6 mg PEG-b-PCL, 70 U/min Rührgeschwindigkeit und 24 Stunden Reaktionszeit. Für den Vergleich der PL-Spektren wurde die Emissionsintensität der QDs im anfänglichen Reaktionsgemisch immer auf eins eingestellt und die anderen Spektren entsprechend skaliert. Die beobachtete Verschiebung der Emissionsmaxima wird auf die Änderung der QD-Umgebung von ursprünglich Styrol/Ethanol zu Polystyrol nach der Polymerisationsreaktion zurückgeführt. Der Anstieg der PL-Intensität der Perlen in den Panels (a,c), die fünfmal mit Ethanol gewaschen wurden, im Vergleich zum PL der Perlen nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden wird auf eine leichte Änderung der Perlenkonzentration und einen Perlenverlust während der Waschschritte zurückgeführt wie aus den entsprechenden Absorptionsspektren im SI hervorgeht (Abb. S4).

REM-Bilder mit der schematischen Darstellung der CdSe/CdS-kodierten Mikrokügelchen und der Größenverteilung, synthetisiert aus (a) OBDAC-beschichteten, OA/OLA-stabilisierten CdSe/CdS-QDs und Styrol (36,6 mg AIBN, zugesetztes Toluol ohne PEG- b-PCL, 200 µL DVB), (b) OA/OLA-stabilisierte CdSe/CdS-QDs und Styrol in Gegenwart des Copolymers PEG-b-PCL (36,6 mg AIBN, 36,6 mg PEG-b-PCL, 200 µL DVB), (c) OBDAC-beschichtete, OA/OLA-stabilisierte CdSe/CdS-QDs und Styrol in Gegenwart von PEG-b-PCL ohne den Vernetzer DVB (100 mg AIBN, 36,6 mg PEG-b-PCL) und (d) OBDAC-beschichtete, OA/OLA-stabilisierte CdSe/CdS-QDs und Styrol mit dem optimierten Verfahren (36,6 mg AIBN, 36,6 mg PEG-b-PCL, 200 µL DVB). Reaktionsbedingungen für alle: 75 °C, 70 U/min Rührgeschwindigkeit, 24 h Reaktionszeit.

In einem ersten Versuch, QD-kodierte Perlen herzustellen, wurden in Toluol dispergierte OA/OLA-stabilisierte CdSe/CdS-QDs durch Zugabe von Ethanol ausgefällt, durch Zentrifugation (5 min bei 8000 U/min mit einer Eppendorf Microcentrifuge 5415 D) abgetrennt und redispergiert aus Styrol. Wie in Abb. 4a dargestellt, verschiebt sich das QD-Emissionsmaximum aufgrund der Änderung der QD-Umgebung nur geringfügig von 625 auf 622 nm, und die FWHM der PL-Spektren ändert sich für QDs mit eingebauten Perlen kaum. Dies weist darauf hin, dass sich die QD-Größe und Größenverteilung während der Polymerisationsreaktion nicht ändern. Die gebildeten QD-kodierten Perlen, die mit DVB vernetzt und in Ethanol dispergiert sind, zeigen eine Abnahme von 80 % im Vergleich zur ursprünglichen Intensität vor der Synthese und PLQY sank von 28 auf 13 % (Abb. 4b). Nach der Perlenreinigung durch Waschen mit Ethanol (5 Wasch-Zentrifugationszyklen) stieg der PLQY um etwa 16 % und erreichte einen Wert von 29 %. Dies wird auf das Vorhandensein freier, möglicherweise beschädigter QDs nach der Perlenherstellung zurückgeführt, die einen niedrigen PLQY aufweisen oder sogar dunkel, also nicht emittierend, sind und nur zur Absorption der Dispersion beitragen, wodurch die resultierende PLQY der Perlendispersion verzerrt wird . Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass unter diesen Bedingungen die Kompatibilität der QD-Oberflächenchemie mit der Polymermatrix schlecht ist, da viele QDs offensichtlich nicht in den gebildeten PS-Partikeln enthalten sind. Außerdem beeinflussen die Polymerisationsbedingungen deutlich die QD-Fluoreszenz, möglicherweise durch Modifizierung der Ligandenhülle. Die PL-Eigenschaften der synthetisierten Perlen (Emissionsmaxima, FWHM, PLQY), die sowohl mit QDs als auch mit NR kodiert sind, sind ebenfalls im SI zusammengefasst (Tabelle S3).

Um die QDs besser abzuschirmen und in der Bead-Matrix zu verankern, untersuchten wir den Einfluss eines zusätzlichen, polymerkompatiblen Oberflächenliganden, hier OBDAC, auf das Reaktionsergebnis. Angeblich interkaliert OBDAC mit der ursprünglich vorhandenen OA/OLA-Ligandenhülle und fungiert als zusätzliche organische Beschichtung um die QDs. Dadurch werden Ligandenaustausch und -entfernung vermieden, die zu Defekt- und Fallenzuständen an der QD-Oberfläche führen können, was zu einer Verringerung der PL-Intensität und des PLQY72 führt. Ein Vergleich der PL-Spektren und PLQY der im SI gezeigten OBDAC-beschichteten OA/OLA-stabilisierten und unbeschichteten QDs (Abb. S2) zeigt das Fehlen spektraler Verschiebungen und Änderungen in der spektralen Breite der QD-Lumineszenzbande. Die PLQY sinkt von 72 %, die für die frisch hergestellten, OA/OLA-stabilisierten CdSe/CdS-QDs in Toluol beobachtet wurden, auf 68 % für die OBDAC-beschichteten QDs um nur 4 %. Wie für das OA/OLA-stabilisierte QD beobachtet, wurde die QD-Emissionsmaximumverschiebung von 627 auf 624 nm für die Mikrokügelchen, die OBDAC-beschichtete QDs und FWHM enthielten, kaum beeinflusst, was darauf schließen lässt, dass sich die QD-Größe und Größenverteilung während der Polymerisation nicht änderte (Abb. 4c). ). Wie in Abb. 4b gezeigt, betrugen die PLQY-Werte der QDs in der Reaktionsmischung vor Beginn der Polymerisationsreaktion etwa 28 %, sowohl für OA/OLA-stabilisierte QDs als auch für QDs, die zusätzlich mit OBDAC beschichtet waren. Allerdings erreichte im letzteren Fall der PLQY der resultierenden QD-kodierten Mikrokügelchen nach 24 Stunden 26 % für die OBDAC-beschichteten, OA/OLA-stabilisierten QDs, was den PLQY-Wert für erstere (13 %) um einen Faktor übersteigt von 2. Für die gewaschenen Mikrokügelchen, die mit OBDAC-beschichteten, OA/OLA-stabilisierten QDs kodiert waren, wurde ein PLQY von 34 % erhalten, was etwas höher ist (um 5 %) als der PLQY der Mikrokügelchen, die OA/OLA-stabilisierte QDs enthalten .

Eine bekannte Herausforderung, die luminophorkodierte Perlen meistern müssen, ist die Verhinderung des Austretens von Luminophor unter anwendungsrelevanten Bedingungen wie Waschschritten, die für die Perlenreinigung erforderlich sind, oder der Anwesenheit von Proteinen oder Tensiden wie Streptavidin, die häufig für Biokonjugationsreaktionen verwendet werden. Da das Waschen der QD-kodierten PS-Mikropartikel mit Ethanol zu einem QD-Austritt führt, selbst bei den OBDAC-beschichteten, OA/OLA-stabilisierten QDs, was durch einen Verlust der PL-Intensität angezeigt wird, also bis zu 5 % DVB (bezogen auf die Styrolmenge). verwendet) wurde dem Polymerisationscocktail als zweites Monomer zur Vernetzung der PS-Matrix zugesetzt. Anschließend untersuchten wir den Einfluss der Perlenvernetzung auf die QD-PL-Merkmale. Die in Abb. 4d dargestellten Emissionsspektren der Reaktionsmischung vor der Polymerisation sowie nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden und nach fünf aufeinanderfolgenden Waschschritten mit Ethanol zeigen deutlich die positive Wirkung des Vernetzers. Wie in dieser Abbildung gezeigt, verschiebt sich das QD-Emissionsmaximum aufgrund der Änderung der QD-Umgebung für OBDAC-beschichtete, OA/OLA-stabilisierte QDs in Gegenwart von DVB von 627 auf 624 nm. Partikel ohne DVB leiden unter einem erheblichen Verlust der PL-Intensität während der Perlenbildung, der nur etwa 40 % der anfänglichen PL-Intensität hemmt und während der Waschschritte sogar auf etwa 10 % der anfänglichen PL-Intensität abnimmt. Durch die Vernetzung wird die Abnahme der PL-Intensität erheblich verringert und das Austreten von QD während der Perlenreinigung verhindert (siehe auch den nächsten Abschnitt). Letzteres wird durch den minimalen PL angezeigt, der im Überstand der gewaschenen, vernetzten QD-kodierten PS-Kügelchen nachweisbar ist (optimiertes Verfahren). Wie in Abb. 4 gezeigt, beeinflusst DVB auch die PLQY der in die Perlen eingebauten QDs. Während mit Werten von 31 % und 28 % die PLQY der QDs im Polymerisationscocktail ohne und mit Vernetzer sehr ähnlich waren, zeigte sich der positive Einfluss von DVB nach der Perlenbildung. Der PLQY der vernetzten Perlen erreichte einen Wert von 26 % und übertraf damit den PLQY der unvernetzten Perlen von 15 % um fast den Faktor 2. Der günstige Einfluss des Vernetzers wurde nach fünf Waschschritten mit PLQY-Werten von 34 % noch deutlicher die vernetzten und 15 % für die nicht vernetzten Perlen. Durch die dichte Kapselung der QDs während der Perlenbildung in einem frühen Stadium der Reaktion kann DVB offenbar nicht nur das Austreten von QDs verhindern, sondern auch Schäden an den OBDAC-beschichteten, OA/OLA-stabilisierten CdSe/CdS-QDs verhindern und sie vor Ethanol schützen , was eine PL-Löschung induzieren kann, z. B. durch irreversible Aggregation der QDs oder Entfernung von Oberflächenliganden.

Die Charakterisierung der QD-kodierten Perlen, die mit OA/OLA-stabilisierten und OBDAC-beschichteten, OA/OLA-stabilisierten QDs unter identischen Reaktionsbedingungen (75 °C, 36,6 mg AIBN, 70 U/min Rührgeschwindigkeit) unter Verwendung von DLS und Elektronenmikroskopie erhalten wurden, ergab beachtliche Ergebnisse Unterschiede in der Perlengröße. Während in Gegenwart des ersteren die Kügelchengröße 872 ± 150 nm betrug, wird für letzteres eine Kügelchengröße von 768 ± 57 nm erhalten (Größen bestimmt aus REM-Bildern). Die entsprechenden REM-Bilder mit den Perlengrößenverteilungen sind in Abb. 5 dargestellt.

Ein Vergleich der in Abb. 5 gezeigten REM-Bilder von unvernetzten und vernetzten PS-Partikeln zeigt eine etwas rauere Oberfläche der vernetzten Perlen im Vergleich zur glatteren Perlenoberfläche, die ohne DVB erhalten wurde. Außerdem erhöht die Anwesenheit von DVB die Perlengröße. Während die vernetzten Kügelchen (hergestellt mit 36,6 mg AIBN) eine Größe von 768 ± 57 nm haben, beträgt die Größe der Kügelchen ohne DVB, aber mit 100 mg AIBN, laut REM-Aufnahmen 1097 ± 91 nm. Die größere Größe des letzteren wird teilweise auf die höhere Menge an AIBN zurückgeführt. Selbst bei ansonsten gleichen Reaktionsbedingungen sind vernetzte Partikel häufig größer als ihre nicht vernetzten Gegenstücke (siehe Abbildung 3 für NR-kodierte Mikrokügelchen). Dieser Unterschied kann auf eine veränderte Reaktionsdynamik zurückgeführt werden, die durch den Vernetzer verursacht wird, z. B. durch Beeinträchtigung der Partikelkeimbildung73. Die Größenverteilung der optimierten, QD-kodierten Perlen ist der der einfachen Perlen sehr ähnlich, mit einer relativ geringen Standardabweichung. Da der Schwerpunkt unserer Studie jedoch auf der Aufrechterhaltung eines hohen PLQY der eingekapselten QDs und der Verhinderung von QD-Lecks lag, war dieser Anstieg der Perlengröße hier nicht relevant. Auch für die meisten Anwendungen solcher QD-kodierten Perlen ist dieser Anstieg der Partikelgröße um etwa 25 % nicht wichtig.

Die QD-Verteilung innerhalb der PS-Mikropartikel, die beispielsweise für alle Arten von Anwendungen relevant sein kann, die auf der Energieübertragung von den kodierenden Fluorophoren zu oberflächengebundenen Fluorophoren beruhen, wurde exemplarisch für ausgewählte Perlen untersucht, die mit OBDAC-beschichteten OA/OLA-kodierten Partikeln kodiert sind. stabilisierte CdSe/CdS-QDs unter Verwendung von STEM mit EDXS und CLSM. Um einen detaillierten Einblick in die QD-Verteilung in einem einzelnen Mikrokügelchen zu erhalten, wurden STEM-Bilder mit einer Beschleunigungsspannung von 200 kV aufgenommen, während die Verteilung von Cd, Se und S, die die Kern-/Schale-QDs innerhalb des Mikrokügelchens bilden, aus EDXS-Messungen abgeleitet wurde. Die erhaltenen Bilder sind in Abb. 6 dargestellt. Das STEM-Bild zeigt die Lokalisierung der QDs in der Perlenkernregion. Dies zeigt auch nur eine sehr geringe Agglomeration oder Aggregation der einzelnen QDs innerhalb der Perle. Die in Abb. 6d gezeigten EDXS-Karten weisen auf das Vorhandensein von Cd und Se in den kodierten Mikrokügelchen hin, was den erfolgreichen Einbau der CdSe/CdS-QDs in die Kügelchen bestätigt. Zusätzliche EDXS-Karten von C und S sind im SI enthalten (Abb. S5). Wie in Abb. 6b, c zu sehen ist, belegen die CLSM-Bilder der QD-codierten Perlen, dass der Ursprung von PL hauptsächlich im Perlenkern liegt. Dies wird deutlich, wenn man die Fluoreszenz mit dem Transmissionsbild vergleicht, wobei letzteres größere Partikel zeigt als die hellen Bereiche im Fluoreszenzbild. Die QD-Akkumulation in der Kernregion wird auf die Hydrophobie der OBDAC-beschichteten, OA/OLA-stabilisierten QDs zurückgeführt, die zusammen mit der Vernetzung mit DVB den QD-Einbau in die ersten Perlenkeime begünstigt, die zu Beginn der Keimbildungsreaktion gebildet werden. Dadurch werden sie weitestgehend aus dem ethanolischen Teil der Reaktionsmischung entfernt.

Lokalisierung der QDs innerhalb der PS-Mikrokügelchen, bestimmt (a) mit einem STEM-Bild von DVB-vernetzten PS-Mikrokügelchen, kodiert mit OBDAC-beschichteten, OA/OLA-stabilisierten CdSe/CdS-QDs, was die Position der QDs im Mikrokügelchenkern enthüllt Region; mit CLSM-Bildern derselben Partikel, gemessen (b) in Fluoreszenz und (c) in Transmission, einschließlich eines Größenvergleichs der fluoreszierenden Fläche und des aus dem Transmissionsbild abgeleiteten Partikeldurchmessers und (d) mit EDXS-Analyse derselben DVB-vernetzten Partikel PS-Mikrokügelchen, kodiert mit OBDAC-beschichteten, OA/OLA-stabilisierten CdSe/CdS-QDs. Reaktionsbedingungen der Partikel in allen Bildern: 75 °C, 36,6 mg AIBN, 36,6 mg PEG-b-PCL, 70 U/min Rührgeschwindigkeit, 24 h Reaktionszeit.

Um die Stabilität des Farbstoffs und der QD-Kodierung weiter zu untersuchen, wurden die unterschiedlich hergestellten und gereinigten kodierten Perlen eine Stunde lang in verschiedenen Medien (MilliQ-Wasser, phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), Dulbecco's Modified Eagle′s Medium (DMEM)) inkubiert 37 °C. Anschließend wurden die Perlen mit Zentrifugalfiltereinheiten (10 kDa, Amicon Ultra, Merck Millipore) abgetrennt und die Menge der freigesetzten Farbstoffmoleküle oder QDs im Überstand photometrisch bestimmt. Die Ergebnisse der Leckstudien werden im SI angezeigt (Abb. S6). Diese Experimente zeigten eine hohe Leckstabilität von NR-Molekülen und QDs in den Mikrokügelchen, da die nachgewiesene Menge an lumineszierender Verbindung in den meisten Fällen weit unter 1 % lag. Bei DVB-vernetzten Mikrokügelchen mit OBDAC-beschichteten, OA/OLA-stabilisierten CdSe/CdS-QDs lag die Menge an freien QDs für MilliQ-Wasser und PBS unter 1 % und für DMEM unter 2 %. Gleiches gilt für die Menge an freiem Farbstoff für DVB-vernetzte Mikrokügelchen mit NR. Bei den NR-kodierten Perlen ohne Vernetzung konnte für alle drei Medien weniger als 1 % freier Farbstoff nachgewiesen werden. Bei OBDAC-beschichteten, OA/OLA-stabilisierten CdSe/CdS-QDs lag die QD-Freisetzung aus ohne DVB hergestellten Mikrokügelchen in MilliQ-Wasser und DMEM unter 1 % und bei PSB bei etwa 1 %. Diese Ergebnisse bestätigen die hervorragende Leckstabilität unserer NR- und QD-kodierten Perlen.

Die kurzfristige Photostabilität der NR- und QD-kodierten Mikrokügelchen wurde mit dem CLSM bewertet. Die Langzeitstabilität wurde mit einem Sonnenlichtsimulator abgeschätzt, hier auch im Vergleich zum Farbstoff NR und den QDs. Die entsprechenden Daten werden im SI angezeigt (siehe Abb. S7).

Die kurzzeitigen CLSM-Messungen zeigten einen etwa exponentiellen Abfall der Lumineszenzintensität der NR-kodierten Kügelchen und einen nahezu linearen Abfall der QD-kodierten Kügelchen. Nach 20 Scans, was etwa 42 s entspricht, hatten die NR-kodierten Kügelchen noch etwa 48 % ihrer ursprünglichen Lumineszenzintensität, während die QD-kodierten Kügelchen 67 % beibehielten. ihrer anfänglichen Lumineszenz.

Wie erwartet zeigten die NR-kodierten Perlen eine sehr begrenzte Photostabilität mit einem erheblichen Lumineszenzverlust selbst nach kurzen Belichtungsintervallen. Die NR-kodierten Perlen zeigen jedoch nach 24-stündiger Beleuchtung bei einer Leistungsdichte von 650 W/m2 im Sonnenlichtsimulator immer noch eine Lumineszenz, wenn auch eine viel geringere verbleibende Lumineszenz als die QD-kodierten Perlen. Nach 72-stündiger Beleuchtung zeigen die NR-kodierten Kügelchen nach 72 Stunden einen mehr oder weniger vollständigen Lumineszenzverlust, während die QD-kodierten Kügelchen nach 120 Stunden Lichteinwirkung immer noch lumineszieren.

Anschließend führten wir Screening-Studien zur Größenabstimmbarkeit der mit OBDAC-beschichteten, OA/OLA-stabilisierten CdSe/CdS-QDs kodierten Polymer-Mikrokügelchen durch und nutzten dabei unser Polymerisationsverfahren, um deren Flexibilität zu bewerten und die relevantesten Parameter für die Perlengrößenkontrolle zu identifizieren. Dazu wurden verschiedene Parameter der zuvor optimierten Polymerisationsreaktion variiert und die Größe der resultierenden Perlen mit DLS bestimmt. Zu den bewerteten Parametern gehörten Temperatur (variiert zwischen 60 und 80 °C), Rührgeschwindigkeit (50–250 U/min), Reaktionszeit (0,5–24 h) und AIBN-Menge (36,6–200 mg), die unter Beibehaltung anderer Synthesebedingungen modifiziert wurden Konstante. Wie in Abb. 7, Tafel a dargestellt, ist die Reaktionstemperatur ein wichtiger Faktor mit erheblichem Einfluss auf die Partikelgröße, deren Erhöhung zu einer Verringerung der Perlengröße führt. Dies wird darauf zurückgeführt, dass sich bei hohen Temperaturen mehr Keime gleichzeitig bilden, was dann automatisch zu einer kleineren Partikelgröße führt. Die bei einer Reaktionstemperatur von 60 °C gebildeten Mikrokügelchen sind relativ klein und die resultierende Perlendispersion weist eine niedrige Perlenkonzentration auf, was darauf hindeutet, dass die Polymerisationsreaktion bei dieser Temperatur deutlich verlangsamt und unvollständig ist. Wie in Tafel b von Abb. 7 dargestellt, begünstigt eine Erhöhung der Rührgeschwindigkeit die Bildung kleinerer Mikrokügelchen, indem die Größe der PVP-Mizellen, in denen die Polymerkügelchen wachsen, verringert wird. Die in Abb. 7c dargestellte Zeitabhängigkeit des Perlenwachstumsverhaltens zeigt, dass bei Reaktionszeiten von bis zu vier Stunden die Partikelgröße schnell und nahezu linear zunimmt. Dann verlangsamt sich die Wachstumsgeschwindigkeit erheblich. Auch die Menge des Radikalinitiators AIBN kann die Größe der Mikrokügelchen beeinflussen (Abb. 7d). Erwartungsgemäß beschleunigt die Verwendung einer größeren Menge an AIBN und damit die Anwesenheit einer größeren Anzahl an Radikalen die Polymerisationsreaktion und führt zu größeren Perlen. Eine AIBN-Menge von mehr als 200 mg verursacht jedoch eine Mikrokügelchenaggregation während der Polymerisationsreaktion.

Partikelgröße von DVB-vernetzten PS-Mikrokügelchen, kodiert mit OBDAC-beschichteten, OA/OLA-stabilisierten CdSe/CdS-QDs, bestimmt durch DLS, erhalten als Funktion systematisch variierter (a) Reaktionstemperatur, (b) Rührgeschwindigkeit, ( c) Reaktionszeit (Proben nicht gereinigt) und (d) Menge an AIBN. In allen Fällen wurden 36,6 mg PEG-b-PCL in Toluol und die gleiche Menge an OBDAC-beschichteten, OA/OLA-stabilisierten CdSe/CdS-QDs verwendet.

In dieser Arbeit haben wir optimierte Verfahren für die Kodierung von Polymermikrokügelchen mit hydrophoben, organischen Farbstoffen und Halbleiterquantenpunkten (QDs) entwickelt, die während der Polymerisation stellvertretend für Nilrot (NR) und CdSe/CdS-QDs, stabilisiert mit Ölsäure (OA), hinzugefügt wurden Oleylamin (OLA). Besonderes Augenmerk wurde auf die Erhaltung der anfänglichen Photolumineszenz (PL) des QD während der Perlensynthese gelegt und zur Optimierung der Herstellung der QD-kodierten Perlen verwendet, was bisher selten systematisch bewertet wurde. Dies bietet auch einen tieferen Einblick in den Einfluss der Perlenbildungsreaktion und einiger ihrer Parameter auf die QD-Lumineszenz. Durch sorgfältige Parameteranpassung konnte die Synthese lumineszierender Mikrokügelchen mit enger Größenverteilung und stabilen Emissionseigenschaften sowie einer relativ hohen Photolumineszenz-Quantenausbeute (PLQY) realisiert werden, obwohl die PLQY im Vergleich zur anfänglichen PLQY der QDs immer noch reduziert ist. Eine Minimierung des PLQY-Verlusts für die in Perlen eingebauten QDs wurde durch die Verwendung des Liganden Benzyldimethyloctadecylammoniumchlorid erreicht, der um die QDs gewickelt war, wodurch die QD-Oberflächenchemie besser mit der Polymermatrix kompatibel wurde, und durch den Vernetzer Divinylbenzol (DVB), um ein Austreten von QDs zu verhindern .

Der entwickelte optimierte Dispersionspolymerisationsansatz ist einfach und ebnet den Weg für die einfache Verwendung und Kombination verschiedener Materialien wie QDs mit unterschiedlichen Zusammensetzungen, Farbstoffen oder anderen lumineszierenden Nanokristallen als Kodierungsmaterialien für die Mikrokügelchen, die dann für optisches Multiplexen und die Kombination verwendet werden können mit magnetischen Nanopartikeln, z. B. zur Immunseparation. Durch die Einführung funktioneller Gruppen in die Mikrokügelchenoberfläche während der Kügelchensynthese können Partikel mit unterschiedlicher Oberflächenchemie hergestellt werden, die weitere Verarbeitungsschritte wie Biokonjugationsreaktionen ermöglichen. In Zukunft planen wir, diese Studien zum Einfluss der Polymerisationsreaktion und des Perleneinbaus auf die Lumineszenzeigenschaften von Nanokristallen auf QDs mit systematisch unterschiedlicher Oberflächenchemie auszuweiten, einschließlich der chemischen Natur und Dicke der Oberflächenpassivierungshülle, der QD-Oberflächenchemie usw Morphologie. Diese kodierten Perlen werden dann für Folgestudien zu möglichen Anwendungen wie Multiplex-Bioassays verwendet.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten oder auf Anfrage erhältlich.

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Wir danken A. Feldhoff vom Institut für Physikalische Chemie und Elektrochemie der Leibniz Universität Hannover für die Bereitstellung der TEM-Einrichtungen und Dr. A. Schaefer vom Institut für Chemie und Biochemie der Freien Universität Berlin für die Bereitstellung der von der DFG geförderten NMR-Einrichtungen. Darüber hinaus danken wir Dr. KD Wegner vom Fachbereich Biophotonik der BAM für fruchtbare Diskussionen und Dr. Thomas Thiele, PolyAn GmbH Berlin für die kritische Lektüre des Manuskripts.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL. L. Scholtz dankt für die Förderung durch das European Metrology Programme for Innovation and Research (EMPIR) im Rahmen des Projekts „AeroTox“ aus der Ausschreibung Gesundheit (18HLT02). Die EMPIR-Initiative wird durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union und durch die EMPIR-Teilnehmerstaaten kofinanziert. JG Eckert dankt der MWK – School for Additive Manufacturing SAM für die Förderung. NC Bigall und F. Lübkemann danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Förderung im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie im Rahmen des Exzellenzclusters PhoenixD (EXC 2122, Projekt-ID 390833453). O. Hübner dankt für die Finanzierung des ERA.Net Rus-Projekts TARQUS.

Fachgebiet 1.2 Biophotonik, Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung (BAM), Richard-Willstätter-Str. 11, 12489, Berlin, Deutschland

Lena Scholtz, Oskar Hübner & Ute Resch-Genger

Institut für Chemie und Biochemie, Freie Universität Berlin, Takustr. 3, 14195, Berlin, Deutschland

Lena Scholtz, Toufiq Elahi & Oscar Hubner

Institut für Physikalische Chemie und Elektrochemie, Leibniz Universität Hannover, Callinstraße 3A, 30167, Hannover, Deutschland

J. Gerrit Eckert, Franziska Lübkemann & Nadja C. Bigall

Exzellenzcluster PhoenixD (Photonics, Optics, and Engineering-Innovation Across Disciplines), 30167, Hannover, Deutschland

Franziska Lübkemann & Nadja C. Bigall

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LS plante und führte die Synthesen durch, mit Ausnahme der Experimente, die zum Screening der Reaktionsbedingungen der Polymerisationsreaktion und der Abstimmbarkeit der Perlengröße im ms beitrugen (Abb. 7), die von TE durchgeführt wurden. Die Messungen wurden von LS geplant und durchgeführt von JGE (SEM, AAS), FL (STEM), OH (CLSM) und LS (DLS, alle Fluoreszenz- und Absorptionsspektroskopie), alle aufgeführten Autoren halfen auch bei der Interpretation der Daten. LS hat das Manuskript mit maßgeblicher Hilfe von UR-G verfasst. und NCB Alle Autoren waren an der Diskussion der Ergebnisse sowie am Korrekturlesen, Überprüfen und Bearbeiten beteiligt und genehmigten das endgültige Manuskript.

Correspondence to Ute Resch-Genger.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 18. April 2022

Angenommen: 04. Juli 2022

Veröffentlicht: 14. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16065-x

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