Neue Perlentechnologie ermöglicht kommerzielle Nutzung

Affinitätschromatographie-Beads, die speziell für mRNA und FPLC entwickelt wurden, eliminieren giftige Chemikalien und reinigen Dutzende Gramm, wodurch ein wichtiger Engpass beseitigt wird

Bevor mRNA-basierte Therapeutika in ausreichenden Mengen für klinische Studien und den kommerziellen Vertrieb hergestellt werden können, muss ein entscheidender Engpass beseitigt werden: die mRNA-Reinigung. Bestehende Methoden reinigen in der Regel nur wenige Gramm mRNA, nicht die benötigten Dutzende Gramm oder gar Dutzende Kilogramm. Um die mRNA-Reinigung zu verbessern, hat Thermo Fisher das POROS Oligo (dT)25 Affinity Resin entwickelt. Im Gegensatz zu alternativen Reinigungsansätzen weist die Chromatographie mit einem perlenbasierten Harz eine hervorragende Skalierbarkeit auf. Bemerkenswert ist, dass das Harz mithilfe einfacher Salz- und Wasserreinigungsschritte selektiv mRNA über den polyadenylierten Schwanz einfängt. [Artur Plawgo/Getty Images]

mRNA-basierte Therapien katapultierten sich in Form von Impfstoffen gegen das SARS-CoV-2-Virus in den Vordergrund des öffentlichen Bewusstseins. Nach diesem Erfolg werden mRNA-Therapeutika nun für eine ständig wachsende Zahl von Indikationen und Anwendungen entwickelt, darunter Krebs, Mukoviszidose und Infektionskrankheiten sowie Gen- und Stammzelltherapien, die entweder auf Genersatz oder Genbearbeitung basieren.

Allerdings muss der Reinigungsengpass gelöst werden, bevor diese Therapien skaliert und in ausreichenden Mengen für klinische Studien oder die Kommerzialisierung produziert werden können.

„Traditionell wurden zur Reinigung von mRNA kleine Werkzeuge und Produkte verwendet, wie etwa Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Fällung und in einigen Fällen zellulosebasierte Chromatographie“, sagt Sirat Sikka, Feldanwendungswissenschaftler bei Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher). Diese Methoden können zur Reinigung einiger Gramm mRNA verwendet werden und eignen sich für Laborarbeiten und einige Anwendungen. Das Scale-up für klinische Studien und die Kommerzialisierung erfordert jedoch die Fähigkeit, Dutzende Gramm oder sogar Dutzende Kilogramm mRNA zu reinigen.

„Bei Thermo Fisher haben wir die Bedeutung von mRNA verstanden und wussten schon vor der Pandemie, dass mRNA weit verbreitet sein würde“, erinnert sich Sikka. Seitdem bezeichnen wissenschaftliche Fachzeitschriften und Fachzeitschriften mRNA-Therapeutika und Impfstoffe gleichermaßen als bahnbrechende Fortschritte, die die Zukunft der Medizin verändern können, sowie die Vereinfachung der Herstellung und die Möglichkeit, auf Signalwege zu zielen, die sonst nicht medikamentös einsetzbar wären. Der Branchenanalyst Research and Markets prognostiziert, dass das globale Segment für mRNA-Therapeutika von 46,7 Milliarden US-Dollar im Jahr 2021 auf 101,3 Milliarden US-Dollar im Jahr 2026 wachsen wird. Das entspricht einer durchschnittlichen jährlichen Wachstumsrate von 16,8 %.

Um für ein so schnelles Wachstum in der mRNA-Entwicklung gerüstet zu sein, begann Thermo Fisher mit der Entwicklung eines neuen Affinitätschromatographieharzes zur Isolierung und Reinigung von mRNA, lange bevor die Technologie zum „Hausbegriff“ wurde. Das Team wollte ein Harz entwickeln, das eine verbesserte Rückgewinnung, höhere Reinheit und verbesserte Reproduzierbarkeit ermöglicht.

Das POROS™ Oligo (dT)25 Affinity Resin – das resultierende Produkt – ist eine 50 µm große vernetzte poröse Poly(styrol-co-divinylbenzol)-Perle, funktionalisiert mit Desoxythymidin (dT)-Strängen, die über den Poly-A-Schwanz an mRNA binden ( eine Kette aus Adeninnukleotiden), die sich am Ende aller mRNA-Moleküle befindet.

Eine der Herausforderungen ist die Größe der mRNA. Es handelt sich um ein großes Molekül – eine Größe von 20 bis 50 nm oder mehr, das je nach Konstruktlänge und Lösungszusammensetzung variiert – daher kann es zu Einschränkungen bei der Diffusion durch das Chromatographiemedium und damit zu einer Behinderung des Stofftransfers kommen, erklärt Sikka. Da die POROS™-Perlen über große Durchgangsporen verfügen, wird die für die Interaktion zwischen Harz und mRNA-Molekül verfügbare Oberfläche vergrößert, was zu einer höheren Kapazität führt. Die großen Poren führen außerdem zu einem verringerten Stoffübergangswiderstand, was zur Verbesserung der Prozesseffizienz und Produktivität beiträgt.

„Das POROS Oligo (dT)25 Affinity Resin minimiert die Notwendigkeit, mit organischen Lösungsmitteln umzugehen, die häufig bei HPLC-Systemen verwendet werden“, fährt Sikka fort. „Der Einsatz großer Mengen organischer Lösungsmittel wird für die Fertigung zu einem Problem.“ Sie führt Sicherheitsbedenken hinsichtlich der Lösungsmittelentsorgung sowie die Notwendigkeit an, entsprechende Anlagen nachzurüsten.

Anstatt giftige Chemikalien zu verwenden, wird die Säule nach der mRNA-Synthese „mit mRNA plus Salz (z. B. NaCl)“ beladen. Dadurch werden die negativen Ladungen der RNA-Moleküle neutralisiert, sodass der Poly-A-Schwanz an die dT-Stränge auf den Perlen binden kann. Dann sagt sie: „Die Elution kann mit einem Puffer mit niedriger Leitfähigkeit oder in manchen Fällen sogar mit Wasser durchgeführt werden.“ Verunreinigungen und Salzionen werden abgewaschen. Wenn das Natrium entfernt ist, stoßen sich die negativen Ladungen von Poly-dT und dem Poly-A-Schwanz gegenseitig ab, wodurch die gereinigte mRNA freigesetzt wird und eine Rückgewinnung von typischerweise über 90 % erzielt wird, abhängig vom Elutionspuffer und der Größe des mRNA-Konstrukts.

Das POROS Oligo (dT)25 Affinity Resin ist für skalierbare Reinigungsprozesse konzipiert und wird daher zum Packen von Säulen für die schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) verwendet. „Die Säulen können entsprechend den Anforderungen der Kunden und auf der Grundlage ihrer Prozessentwicklung und -optimierung auf mehrere Säulengrößen gepackt werden“, sagt Sikka. „Wir haben auch kleinvolumige Fertigsäulen und Robosäulen. Die vorgepackten 1-ml- und 5-ml-Säulen könnten bei Bedarf mit HPLC verwendet werden, aber das würde den Kunden nur die Reinigung sehr kleiner Probenvolumina ermöglichen, könnte eine Neuinstallation erfordern und ist normalerweise nicht ideal für die Prozessentwicklung, daher ist ein Wechsel zu FPLC vorzuziehen. Was Kunden bei der Wahl dieses Harzes vor allem suchen, ist die Möglichkeit, die Reinigung zu steigern, sodass sie es mit FPLC-Systemen verwenden.“

Laut Sikka ist dieses Affinitätsharz eine gute Option für Wissenschaftler, die an der Entwicklung eines Plattformprozesses interessiert sind, der für eine Vielzahl von mRNA-Konstrukten implementiert werden kann. Einer der Vorteile der Verwendung von mRNA besteht darin, dass dasselbe Konstruktrückgrat möglicherweise zur Expression verschiedener Proteine ​​​​verwendet werden könnte. Dadurch können Wissenschaftler potenziell einen Plattformprozess für mehrere mRNA-Programme nutzen.

Während Forscher möglicherweise das Gen von Interesse austauschen, „könnten sie immer noch mit mRNA vergleichbarer Größe arbeiten“, erklärt Sikka. „Wenn beispielsweise je nach Protein, das sie exprimieren möchten, der Größenbereich aller Konstrukte zwischen 4000 und 6000 Basen liegt, könnten sie dies als ersten Erfassungsschritt nutzen und einen Plattformprozess entwickeln.“ Die Arbeit mit viel größerer mRNA, beispielsweise der Selbstamplifikation, könnte einige zusätzliche Entwicklungen erfordern.

Als Plattformtechnologie würde der erste Reinigungsschritt mit POROS Oligo (dT)25 verdaute DNA-Matrizen, Nukleotide, Enzyme und Pufferkomponenten entfernen. Dies könnte der einzige Schritt im Prozess vor der Konzentration und dem Pufferaustausch sein. Bei Bedarf kann ein zweiter Chromatographieschritt mit POROS™-Harzen für hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) oder Anionenaustauschchromatographie (AEX) entwickelt werden, um doppelsträngige RNA und nicht verkappte oder restliche unvollständige RNA-Transkripte zu entfernen.

„Wenn Wissenschaftler in der Forschungs- und Entdeckungsphase mit diesem Harz beginnen, können sie bis zur kommerziellen Herstellung weiterhin dasselbe Reinigungsharz verwenden“, sagt sie. „Dies erleichtert auch den Übergang von einem mRNA-Konstrukt zu einem anderen ähnlicher Größe.“

Sie führt aus: „Sobald das Harz in einem Prozess verwendet wird, ist es bereits im System und wird vom Qualitätsteam des Kunden akzeptiert.“ Darüber hinaus müssen Wissenschaftler ihre Reinigungsschritte nicht in jeder Phase der Skalierung neu entwickeln, wodurch die Notwendigkeit, eine Vielzahl von Chemikalien und Lösungen einzubeziehen oder unterschiedliche Pufferzusammensetzungen zu entwickeln, minimiert wird, wodurch die Prozessentwicklung beschleunigt und die Zeit bis zur Markteinführung verkürzt wird. Die Harze sind außerdem wiederverwendbar, was die Warenkosten senkt.

„Wichtig ist, dass POROS Oligo (dT)25 Affinity Resin-Perlen für die GMP-Produktion verfügbar sind und wir das regulatorische Unterstützungspaket bereitstellen“, sagt Sikka.

Der Wechsel zum POROS Oligo (dT)25 Affinity Resin ist lediglich eine Frage der Bestellung der vorgepackten Säulen, wenn Kunden bereits FPLC verwenden.

„Viele unserer Kunden befinden sich jedoch noch im Forschungsstadium und sind an einer Ausweitung interessiert“, betont Sikka. „Sie verfügen nicht unbedingt über FPLC-Systeme und versuchen, ihre Möglichkeiten zu verstehen.“

In solchen Fällen empfiehlt sie die Bestellung von losem POROS Oligo (dT)25Affinity Resin, das im Batch-Modus in Spin-Säulen oder Mikrozentrifugenröhrchen verwendet werden kann. Wenn dies für ihre Zwecke gut funktioniert, können sie die Investition in eine FPLC zur weiteren Optimierung der Reinigung und Skalierung in Betracht ziehen.

„Thermo Fisher konzentriert sich sehr auf die Moderne“, sagt Sikka, mit Lösungen, die aktuelle und aufkommende Reinigungsherausforderungen angehen. Das bedeutet heute einen intensiven Fokus auf die mRNA-Reinigung.

Da das Interesse an mRNA-Therapeutika weiter zunimmt, konzentriert sich die Forschung und Entwicklung des Unternehmens auf das Verständnis der Komplexität, die mit der Reinigung selbstverstärkender mRNA, der Entfernung produktbezogener Verunreinigungen wie doppelsträngiger RNA und abortiven Transkripten sowie der Verwendung von POROS Oligo (dT)25 Affinity verbunden ist Harz und andere Technologien zur Lösung bestehender und aufkommender Herausforderungen.